Lateks Aglütinasyon Nedir

Streptococcus pneumoniae (pnömokok) beş yaşın altındaki çocuklarda morbidite ve mortalitenin önemli bir nedeni eski dünya çapında, özellikle kaynak fakir ayarlarında ^1,2,. Zatürree, sepsis gibi hayatı tehdit eden durumlara lokalize enfeksiyonlardan Pnömokok hastalığı aralıkları ve ^1,2 menenjit.

Pnömokokların fazla 90 serotip tespit onların kapsül polisakkarit ³ farklılıklara dayalı olmuştur. Şu aşılar kapsüler polisakkarit hedef ve invaziv hastalık ⁴ neden önemli serotipten koruma sağlar. Pnömokok izolatlarının serotiplendirme taşıma ve hastalık üzerine aşılamanın etkisini değerlendirmek yanı sıra geniş epidemiyolojik bilgiler ^5,6 sağlanması için önemlidir. Pnömokok tipleme için geçerli 'altın standart' yöntemi kapsül şişme deneyi testi, ama zaman alıcıdır ve perfo bazı beceri gerektirirrm ^7. Lateks aglütinasyon Dünya Sağlık Örgütü tarafından ⁷ alternatif bir serotipleme yöntemdir. Lateks aglütinasyon gerçekleştirmek için hızlı ve basit, ve dünya çapında birçok laboratuvarda kullanılmaktadır. Önemli olarak, lateks aglütinasyon pnömokok serotipleme ^10, için kapsül şişme deneyi test etmek için karşılaştırılabilir kesinliği göstermiştir. Genel olarak, bu yöntem, kaynak yoksulluğu yanı sıra yüksek miktarda laboratuarlar için idealdir.

Lateks aglütinasyon reaktifler ('lateks reaktifleri') lateks parçacıkları ¹⁵ antikorların bağlanması ile oluşturulur. Pozitif bir reaksiyon olarak, bu etiketlenmiş parçacıklar, spesifik bir antijenin varlığında tutunurlar. Ticari lateks reaktifleri Serotiplerin sınırlı bir aralığı için mevcuttur. Lateks reaktifleri aynı zamanda ticari olarak temin edilebilen anti-serumlar kullanılarak ¹⁰ in-house hazırlanabilir. Antiserumlar karışımları ("havuzlar") yanı sıra, pnömokokkal s özgü antiserumlarerogroups (örneğin, grup 19), tek tek serotip (örneğin, serotip 5), ve belirli antijenlere karşı ("faktör", örn., serotip 19A tanıyan faktörü 19c) ayrıca, grup içinde serotipleri tanımlanması için ¹⁶ mevcuttur.

Bu yazıda, lateks parçacıkları için ticari olarak temin edilebilen antiserumlar pasif ucunu kullanarak lateks reaktiflerin üretilmesinde adımları açıklamaktadır. Bu yöntemin Kalite kontrol (KK) yönlerini tarif edilmiştir ve pnömokok tipleme için lateks reaktiflerin kullanımı için bir protokol dahildir.

Içi Lateks Ayıraçların hazırlanması 1.

1. Glisin tamponlu tuz hazırlanması (GBS)
   1. g glisin, g sodyum klorid ve ml'lik bir cam şişeye damıtılmış su, ml ilave edilir.
   2. Manyetik bir karıştırıcı kullanarak çözmek üzere karıştırılır.
   3. Bir ölçme silindiri ml karışımı aktarın ve ml lik bir toplam yapmak damıtılmış su ilave edilir.
   4. , ml'lik bir cam kaba geri çözeltisini pH'ı kontrol edin ve 5 M sodyum hidroksit ile olarak ayarlanır. NOT: Sodyum hidroksit aşındırıcı, kişisel koruyucu ekipman giyin.
   5. Filtre ml'lik preautoclaved vidalı kapaklı cam şişeye mcM filtreleri ve çok sayıda 60 ml şırınga kullanarak çözüm sterilize.
   6. Oda sıcaklığında saklayın.
2. % büyükbaş hayvan serum albümini ile GBS hazırlanması
   1. ml'lik bir cam kabın, büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) tozunun gramı ve GBS ml ilave edilir ve manyetik bir karıştırıcı kullanılarak eritmek için karıştırın.
   2. Filtre ml'lik bir preautoclaved vida kapaklı bir cam şişeye çok sayıda 60 mi şırıngalar uM filtre yoluyla çözeltinin sterilize edin.
   3. 4 ° C'de saklayın.
3. Lateks reaktif hazırlama
   1. Alt mikrofuge'ye tüp yuvarlak bir 2 ml etiketleyin.
      Not: tüpler yuvarlak tabanlı bir antikor bağlanmasını etkileyebilir parçacık çökmesini en aza indirmek için kullanılır.
   2. Steril uçları işlemi, mikrofüj tüpüne GBS ul ile P pipet kullanarak, daha sonra lateks tepkime maddesi (yani, havuz, grup, tip veya faktör) hazırlanan uygun pnömokok antiserumu 25 ul ekle. Karıştırmak için beş kez ters çevirin.
   3. Steril fizyolojik salin ul lateks partikülleri ul ekleyerek polistiren lateks parçacıkları seyreltin.
      NOT: Bu daha fazla hacimlerde yapılabilir, ancak lateks reaktifler üretilmiş taze her yapılmalıdır.
   4. 1 (adım hazırlanan) lateks süspansiyonu ul ekleyin, ul antiserumu süspansiyonu (aşama hazırlandı). Karıştırmak için beş kez ters çevirin.
   5. Yavaş dönen bir tekerlek üzerinde 37 ° C'de inkübe edilir (örneğin, cm çapa sahip bir tekerlek için 4 rpm) 2 saat karıştırıldı.
   6. 1, x g'de 15 dakika boyunca santrifüj. Süpernatantı atın ve yavaşça steril tuzlu 2 ml pelletini.
   7. 1, x g'de 15 dakika boyunca santrifüj. Süpernatantı atın ve GBS 1 ml ekleyin ve hafifçe pelletini.
   8. Etiketli bir 5 ml lateks süspansiyonu pipetle tüp kapatıldı vida. GBS başka 1 ml ekleyin.
   9. GBS (pH ) (adım hazırlandı) (ağ / hac)% BSA ihtiva eden 2 ml ilave edilir. % 10 bir koruyucu olarak sodyum azid (ağ / hac) çözeltisi 40 ul ekle.
      NOT: Sodyum azid solunması halinde tehlikeli olduğunu ve bir cilt ve göz tahriş edicidir. Bu inhalasyon yoluyla temas riskini en aza indirir gibi, toz halinde yerine hazırlanmış bir% 10 çözelti satın almak için arzu edilir. Eldiven, bir de dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipmanlar (Bu reaktifi işlerken d gözlüğü) giyilmelidir. Ayrıntılar için Malzeme güvenlik veri sayfasına bakın.
   10. 4 ° C'de saklayın lateks reaktif ile gerçekleştirilebilir.
4. Negatif kontrol lateks tepkin maddesi hazırlanması
   1. Alt mikrofuge'ye tüp yuvarlak bir 2 ml etiketleyin.
      Not: tüpler yuvarlak tabanlı bir antikor bağlanmasını etkileyebilir parçacık çökmesini en aza indirmek için kullanılır.
   2. Steril uçları işlemi, mikrofüj tüpüne GBS ul ile P pipet kullanarak, daha sonra 25 ul normal tavşan antiserumu ilave edin. Karıştırmak için beş kez ters çevirin.
   3. Adımlarda devam yukarıdaki için

2. Kalite Kontrol Lateks Ayıraçların (QC)

1. Oda sıcaklığına kadar lateks tepkin maddesi getirin. Kullanmadan hemen önce, yavaşça Tüpü birkaç kez baş aşağı çevirerek lateks tepkin maddesi karışımı.
2. Bir cam mikroskop lamı üzerine 15 ul pipetleyerek autoagglutination için ayıraç edin ve adımları ve aşağıda gibi devam edin. Hayır olmalıLateks partiküllerin gglutination. Reaktif beyaz ve pürüzsüz görünmesi gerekir.
3. Düşük geçiş pnömokok izolatı bir paneli karşısında reaktif edin. Izolatların paneli 'hedef' serotipin izolatlarınının (reaktif madde için spesifik serotip test ediliyor) ve 'hedef olmayan' serotiplerini (normalde çapraz olmamalıdır diğer Serotiplerin izolatlarınının içermelidir 3. adımda hazırlanan taze yetiştirilen kültürler kullanın ) tepkin maddesi ile reaksiyona girer. QC geçiren Her bir lateks tepkin maddesi için, her bir hedef ve hedef olmayan serotip en az bir izolat içerir. Serotipte sadece bir hedef ya da hedef olmayan serotip, Test, iki farklı izolat ise.
   NOT: Test paneli invazif hastalık ve / veya tip kültür koleksiyonlarından nadir bazıları her çeşitli serotip izole, içermelidir. Genellikle (veriler gösterilmemiştir) serotipi için daha fazla çaba gerektirir gibi ve dolayısı ile de gücü o test bazı taşıma izole dahil etmek tercih edilirreaktifler f ve reaktifler invaziv ve taşıyıcısını izolatlarının hem serotiplendirme olası yeteneğine sahip olmasını sağlamak.
4. Hedef ve hedef olmayan pnömokok lateks reaktiflerin Test devam adımları 3 ve 4 de tarif edilen yönteme göre izole edildi.
5. Sonra en az yılda daha sonra üretim zamanı ve kalite kontrol reaktifleri.
   NOT: Bir reaktif QC geçemezse, toplu atılır ve yeni bir hazırlama yapılmalıdır. Tekrar QC arızası durumunda biz reaktifler Ortika ve ark. ⁸ ve aşağıdaki tartışmada tarif edilen alternatif yöntemler kullanılarak üretilebilir önerilir.

Serotiplemeye Pnömokok Kültürler 3. hazırlanması

1. Steril bir spiral kullanarak pnömokok tek bir koloni seçin Primer inokulum plaka yüzeyinin yaklaşık üçte birini kapsayan ve böylece sağlam bir seçici olmayan kan agara bunu izole ve çizgi. Tek koloniler için Streak.
   NOT: defibrinleştirilmiş at veya koyun kanından hazırlanan levhalar uygundur; ama insan kanı veya Sitratlı hayvan kanı ile hazırlanan kan plakaları değildir.
2. % 5 _CO2 içeren bir atmosferde 37 ° C'de levha O / N inkübe _edin.
3. Saflık plaka üzerinde büyüme dikkate ve tipleme için yeterli gelişme olduğunu değerlendirmek.
   Not: pnömokok izolatı saf bir kültürü tipleme için gereklidir. Levha yüzeyi yaklaşık olarak üçte birini kaplayan deneyim konflüent, veya yapışık yakınındaki büyüme genellikle serotipleme tamamlamak için yeterlidir. Pnömokok kültürler autolysis eğilimli olabileceğinden, tipleme için hazırlanan kültürler altkültür, 24 saat içinde test edilmelidir. Serotipleme başlamadan önce en fazla 15 20 dakika kuluçka kültür plaka almayın.

4. İletken Lateks Aglütinasyon Serotipleme

1. Yaklaşık için oda sıcaklığında bunları buzdolabı tüm reaktifler lateks ayırın ve30 dakika nerdeyse. Kullanmadan hemen önce, yavaşça reaktifleri karıştırmak için tüpler ters.
2. Bir mikroskop lamı etiketleyin.
3. Mikroskop lamı üzerine negatif kontrol lateks reaktifi 15 ul yerleştirin.
4. Döngü yaklaşık yarısı dolu olacak şekilde steril tek kullanımlık 1 ul döngü kullanarak pnömokok kültürünün bir süpürme alır.
5. Hafifçe negatif kontrol lateks tepkime maddesi damla yakın sürgü yüzeyine inokulum smear. Inokulum cam slayt üzerinde görünür olmalıdır.
6. Hızlı ve iyice döngü kullanarak negatif kontrol lateks ayıraç içine inokulum karıştırın. Damla başlangıç ​​boyutundan daha fazla yaymak değil emin olun.
7. Iki ucunda tutarak, slayt Pick up. Ileri ve geri 1 dakika için slayt sallayın. Yavaş yavaş hareket sıvı tutmak ve damla büyüklüğü artmaz emin olmak için özen gösterin.
   NOT: Alternatif bir tabak rocker kullanın.
8. Makroskopik aglütinasyon (yani, tarafından gözlemlemekçıplak göz) ve siyah bir arka plan karşı süspansiyon takas.
9. Negatif kontrol lateks reaktifi hiçbir aglütinasyonunu gösterir veya takas yukarıdaki adımları 4,,8 olarak negatif kontrol lateks reaktifin test lateks reaktifleri yerine, kültürünü test devam edin. Taze bir döngü, her zaman kullanılmalıdır. Havuzları ile başlayan lateks reaktiflerin test ile devam edin.
10. Bir pozitif test elde edilene kadar arka arkaya 'Havuz' lateks reaktifleri her test edin.
    NOT:. Örneğin, ilk slaytta üç büyük olasılıkla havuzları için test özellikle serotip (yerel insidansını yansıtmak için 'tur' yapılabilir havuzlarının test sırası bir pozitif reaksiyon elde değilse, o zaman testi ) ve böylece pozitif bir tepki elde edilene kadar, bir sonraki üç ikinci slayt üzerinde kalan havuzları muhtemelen. Bu, en yaygın serotipler gereken zamanı en aza indirmek ve reaktifler, birinci test edilmesini sağlamaktadır.
11. Antiserumlar üreticinin anahtarını kullanarak olumlu havuzunda temsil bireysel hangi antiserumlar belirler.
12. Yukarıdaki adımları 4,,8 olarak "grup" ya da "türü" belirlemek için ayrı ayrı pozitif havuz içinde yer alan bir gruba ya da türlerinin her biri test edin.
13. Antiserumlar üreticinin anahtarına referans ile bu sonuç belirler. Bir 'tür' tespit edilirse (örneğin, serotip 5), daha sonra başka test gerekli ve bu sonuç kaydedilir.
14. 'Grup' tespit edilirse (örneğin, grup 19), daha sonra test edilecek faktörleri belirlemek için üreticilerin anahtarına bakın. Bireysel 'faktörü' lateks reaktifleri ile teste devam ve son serotipik (örneğin, serotip 19B) belirler.

Lateks partikülün tip-spesifik antikor pneumococcus un kapsülünün bağlanır ve buradaki antikor etiketlidir partikülleri aglütinasyonu ¹⁵ gelişir olduğunda pozitif bir lateks reaksiyon meydana gelir. Şekil 1A arka görünür aglutinasyon testi ve temizleme ile karakterize edilen bir pozitif reaksiyonunu göstermektedir süspansiyonu. Negatif bir reaksiyon yumuşak ve beyaz (Şekil 1B), kalan lateks aglütinasyon reaktif süspansiyonu ile karakterize edilir. Bir pozitif reaksiyon, bir dakikalık bir zaman süresi içinde (yaklaşık 20 saniye içinde, genellikle tespit edilebilir) sonuna kadar dikkat edilmesi gerektiğini, böylece ayıraçlar optimize edilmiştir. Biz 1 dakikalık bir zaman aralığından sonra tepkilerini okuma önermiyoruz. Çok nadiren, reaksiyonlar arka süspansiyon temizleyerek eşliğinde, ya da hiç plan temizlenmesi ile kılçıklı 'görünmez bir damla kenarında zayıf aglütinasyonunu görüntülemek (veriler gösterilmemiştir). Bunlar çoğu gibi ly olumsuz tepkiler. Bu tür durumlarda, retesting ve / veya başka bir serotip yöntemi (örneğin kapsül şişme deneyi tepkime karışımı ¹⁷⁾ ile daha ileri araştırmalar önerilir.

Şekil 1. Pozitif ve negatif lateks aglütinasyon reaksiyonları. Bir pnömokok hazırlıklar pozitif reaksiyon (A) veya olumsuz bir tepki (B) gösteren lateks aglütinasyon maddesi ile karıştırılır izolat. Arka temizlenmesi eşlik Yapıştırma .Orada negatif kontrol lateks tepkin maddesi ya da bir negatif test reaksiyonu (B) görünür bir aglütinasyon olan pozitif reaksiyon, (A) olarak görülmektedir. Fotoğraf ⁸ izni ile kullanılır."Target =" _blank "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Lateks aglütinasyon pnömokok tipleme için basit, hızlı ve ucuz bir yöntemdir. Ticari pnömokok lateks aglütinasyon reaktifler kullanılabilir, ancak şu anda bilinen tüm pnömokok ^10,12 serotipleri ayrım yoktur. Ancak, lateks aglütinasyon maddeleri kolayca belirli pnömokok kapsüler antigenlere karşı ortaya çıkan anti-serumlar kullanılarak satın içerisinde imal edilebilir. Burada tarif edilen yönteme göre, antikorlar pasif lateks aglütinasyon reaktif bir set yapmak için lateks parçacıkları eklenir.

Pnömokok polisakkarit kapsül ^18,19 izole üzerinde lateks partiküllere bağlı spesifik antikorların antijenlere taktığınızda pozitif lateks bir reaksiyon oluşur. Antikorlara bağlı lateks partikülleri spesifik bir antikor-antijen reaksiyonu, büyütme olmadan gözlemlenmesini sağlar.

Lateks aglütinasyon yüksek kapasiteli laboratuvarlar için uygun bir yöntemdirkaynak fakiri ayarları için de d. Lateks aglütinasyon yöntemi önemli avantajları hiçbir özel ekipman testi gerçekleştirmek için gerekli olduğunu vardır, reaktifler 4 ° C'de ⁸ de depolandığında en az 2 yıl raf ömrü var ve bu, basit, ucuz ve hızlı olduğunu gerçekleştirmek için. Lateks kümelenme bir pnömokok izolatı serotip yaklaşık 10 dakika sürer, ve dört adete kadar lateks reaktifler, bir slayt üzerinde paralel olarak test edilebilir. Serotiplerin sıklığı önemli bir epidemiyolojik ayarı için bilinen Ayrıca, eğer, deneme testi ¹⁷ kapsül şişme deneyi benzer yaygın olan serotipleri içeren havuzlara başlayarak mermi gerçekleştirilebilir. Bu yaklaşım, bir serotip belirlemek için gereken test sayısını en aza indirir. Yöntem ayrıca, farklı operatörler arasında yüksek oranda tekrarlanabilir olduğunu (veriler gösterilmemiştir). Lateks aglütinasyon serotipleme bir dezavantajı, reaktif maddeler üreten yaklaşık 4 saat alarak, zaman tüketen olmasıdır; Birden fazla tepkili olmasına rağmenNTS kolayca paralel olarak üretilebilir. Ayrıca, bazı antijenler, bazı anti-serumlar ile çapraz tepkime ile sonuçlanan farklı pnömokok serotipleri ortak olan (örneğin, serotip 29, 42, Grup 35). (Genellikle daha sorunlu çapraz reaksiyona giren antikorları uzaklaştırmak için absorplanmıştır edilir), ticari antiseranın ve ek reaksiyon tabloları kullanarak mevcut olan serotip ayırt etmek için üretici tarafından sağlanan Ancak, bu çapraz reaksiyonlar iyi karakterize edilir. Antikorlar lateks parçacıkları üzerinde düzgün hizalanmış değilse de geçebilir lateks reaktifleri tepki; Bu QC başarısızlık olarak algılanır. Bizim deneyim, titiz QC piyasada mevcut antiserumlar üretim için kullanıldığında bile, bu yöntemin başarısı için esastır. QC reaktif başına yaklaşık olarak 15 dk ve yukarıda tarif edildiği gibi izole edilen uygun QC bir dizi dayanır.

Burada tarif edilen metot, bir pozitif reaksiyon de wi elde reaktifler ile sonuçlanırtest süresi ince. Bizim tecrübelerimize göre, yanlış pozitif (veriler gösterilmemiştir) pratikte nadirdir. Arasıra yanlış negatif reaksiyonlar gözlenir; Genellikle, bu, belirli bir antiserum ile bilinen sorunlar (örneğin serogrup 6 izolatı Havuz B antiserumu ile reaksiyona girmemekte) veya izolatı ile kapsül ekspresyonunun aşağı regülasyonu ile ilgilidir. Yanlış pozitif veya negatif reaksiyon, bir kör uç 'sonucu verir çoğu durumda imalatçı tarafından sağlanan serotip algrorithm kullanılması da önemlidir. Reaksiyonları yorumlamak zor olduğunda bu gibi durumlarda, ve biz bu kapsül şişme deneyi reaksiyonu gibi alternatif bir yöntemle tekrar-test ve / veya testini öneririz.

Bazı sorun giderme bazen tatmin edici lateks reaktifleri yapmak için gereklidir. Burada açıklanan yöntem, antikor pasif adsorpsiyon ^15,19 ile, lateks parçacıkları bağlanmış, böylece kritik bir değişkendir kadar iyi belirler ikinci antikor konsantrasyonu, birLateks partiküllerin yüzeyi kapalı ve antikor, aktif alanlarının ^15,20 sonraki hizalamasıdır. Yetersiz veya aşırı antikor, lateks partiküllerin de bağlı olduğu Sonuç olarak, eğer, antikor-antijen reaksiyonu optimum olmaz ve tatmin edici reaktifler ^15,20,21 üretilebilir. Antikor titreleri antiserumların farklı partiler arasında değişir gibi, dilüsyonlarının standart bir dizi kuyu ⁸ gerçekleştirmek reaktifler üretmek olmayabilir. Yararlı bir başlangıç ​​noktası antiserumun bir seyreltme kullanımı ve bu başarılı değilse, daha da antiserumu seyreltin. Bizim tecrübelerimize göre bu genellikle sorunu ⁸ giderir. Vakaların küçük bir sayıdaki belirteçler hedef izolatları ile test edildiğinde süspansiyon takas eşlik etmediği zayıf aglütinasyon gösterebilir. Reaktifin kalitesini geliştirmek değil, ama tatmin edici reaktifler genellikle santrifüj ihmal ederek üretilebilir ve yıkama adımları ^8,22 antiserumu seyreltilmesi Bu durumda

Antikor kaplı lateks parçacıkları çok farklı mikropların ^15,20 tespiti, kimlik veya tipleme için tanısal mikrobiyoloji yaygın kullanılmaktadır. Bu nedenle, burada tarif edilen yöntem, diğer amaçlar için lateks tepkin maddeleri hazırlamak için uygun olabilir, Resim uygun antiserumlar kullanılabilir ve yeterli kalite kontrol prosedürleri kabul edilir.