Phytone Peptone

1928 yılında penisilin keşfinden bu yana, çevresel mikroorganizmalardan elde edilen doğal ürünler antimikrobiyal bileşiklerin zengin bir kaynak olduğu kanıtlanmıştır^1. Doğal ürün antibiyotiklerin yaklaşık % 80'i Streptomyces ve diğer aktinomycetes cinsinin bakterilerinden elde edilirken, geri kalan %20'si mantar türleri tarafından üretilmektedir^1. Klinikte β-laktamlar, tetrasiklinler, rifamycins ve aminoglikozitler gibi en yaygın antibiyotik iskelelerinden bazıları başlangıçta mikroplardan izole edilmiştir². Ancak, çoklu ilaca dirençli (MDR) bakterilerin yükselişi nedeniyle, antibiyotik mevcut panel tedavide daha az etkili hale gelmiştir^3,4. Bunlar arasında "ESKAPE" patojenleri (yani vankomisindirençli enterokoklar ve β-laktam dirençli Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, ve Enterobacter sp.), dünya sağlık örgütü 3 gibi büyük halk sağlığı yetkilileri nin en yüksek risk ile ilişkili olduğu düşünülen bakterilerin bir alt kümesi olan^3,4,5. Bu MDR patojenlerinin ortaya çıkması ve küresel yayılması yeni^{antibiyotikler}için sürekli bir ihtiyaç^3,4,5sonuçları . Ne yazık ki, son yirmi yılda mikrobiyal kaynaklardan yeni antibiyotiklerin keşfi giderek zor olduğunu göstermiştir⁶. İlaç keşfi için mevcut yaklaşımlar biyoaktif bileşiklerin yüksek iş gücü tarama dahil, doğal ürün özü kütüphaneler de dahil olmak üzere, belirli bir zamanda test edilecek özleri binlerce izin². Ancak, bir kez antimikrobiyal aktivite tespit edilir, bir sonraki adım aktif bileşeni tanımlamak ve bilinen veya gereksiz bileşikler⁷içeren ortadan kaldırmak için ham özü içeriğini analiz etmektir^{7 ,8}. Bu süreç, dereplication olarak anılacaktır, önlemek ve / veya önemli ölçüde bilinen^{antibiyotiklerin}yeniden keşfi harcanan zamanı azaltmak için hayati önem taşımaktadır 7^,9. Doğal ürün ilaç keşfi gerekli bir adım olmasına rağmen, dereplication kötü üne sahip zahmetli ve kaynak yoğun¹⁰.

Beutler ve ark. ilk dönem "dereplication" icat beri, geniş çabalar bilinen antibiyotiklerin hızlı belirlenmesi için yenilikçi stratejiler geliştirmek için yapılmıştır^11,12. Bugün dereplik için kullanılan en yaygın araçlar yüksek performanslı sıvı kromatografisi, kütle spektrometresi ve nükleer manyetik rezonans tabanlı algılama yöntemleri^11,13gibi analitik kromatografik sistemleri içerir. Ne yazık ki, bu yöntemlerin her biri pahalı analitik ekipman ve sofistike veri yorumu kullanımını gerektirir.

Hızla özel ekipman olmadan yapılabilir bir dereplication yöntemi geliştirmek için bir girişim, biz antibiyotik direnç platformu (ARP)¹⁰kurdu. ARP antibiyotik adjuvants keşfi için kullanılabilir, bilinen direnç mekanizmalarına karşı yeni antibiyotik bileşiklerin profilleme, ve aktinobakteriler ve diğer mikroplardan elde edilen özlerde bilinen antibiyotiklerin derepifasyonu. Burada antibiyotik derepyonu uygulamasına odaklanıyoruz. ARP en sık yeniden keşfedilen antibiyotiklere karşı etkili bireysel direnç genleri ifade izojenik Escherichia coli suşları bir kütüphane kullanır^14,15. E. coli kütüphanesi ikincil bir metabolit üreten organizmanın varlığında büyüdüğünde, bileşiğin kimliği, ilişkili direnç^geniniifade eden E. coli suşlarının büyümesi ile ortaya çıkarılabilir 10 . ARP ilk rapor edildiğinde, kütüphane 16 antibiyotik sınıfına direnç kazandıran >40 genden oluşuyordu. Orijinal dereplication şablonu derepifasyon işlemi sırasında antibiyotik alt sınıf ile ilgili bilgi sağlamak için antibiyotik sınıfı başına direnç genlerinin bir alt kümesini kapsayacak şekilde tasarlanmıştır. Bugün, ARP 18 antibiyotik sınıflarına direnç veren >90 genlerden oluşmaktadır. Direnç genleri bizim geniş koleksiyonu kullanarak, ikincil bir dereplik şablonu geliştirilmiştir ve minimal antibiyotik direnç platformu (MARP) olarak bilinir. Bu şablon, gen artıklığını ortadan kaldırmak ve sadece dereplicated metabolitin ilişkili olduğu genel antibiyotik sınıfı ile ilgili bilgi sağlamak için oluşturuldu. Ayrıca, MARP şablonu hem wildtype ve E. coli BW25113(E. coli BW25133ΔB ΔBΔtolC)bir hiperpermeable / efflux eksik suşu sahip, Sadece ARP orijinal cisimleşme ile karşılaştırıldığında, hiperpermeable suş kullanır. Bu benzersiz yönü dereplik sırasında ek fenotipler oluşturur, Gram-negatif bakterilerin dış membran çapraz bir bileşikler yeteneği gösteren. Burada, ARP ve/veya MARP ile çoğaltma yaparken izlenecek sağlam bir protokolü açıklar, izlenecek en kritik adımları vurgular ve çeşitli olası sonuçları tartışırız.

1. E. coli Kütüphanesi Gliserol Stoklarının Hazırlanması (Agar Eğimlerinden)

1. ARP/MARP E. coli suşlarını lysogeny suyu (LB) agar eğimlerinden LB agar ve uygun seçilebilir marker içeren Petri kaplarına doğru çizgileyin(Tablo 1).
2. Tek bir koloni ile uygun seçilebilir marker içeren LB 3 mL aşılayarak E. coli suşlarının her biri için kültürler hazırlayın. Havalandırma (250 rpm) ile 37 °C'de bir gecede büyüyün.
3. 800 μL kültür ve 200 μL steril% 80 gliserol bir 1.8 mL cryovial birleştirin. Tüpleri 3−4 kez ters çevirerek karıştırın ve -80 °C'de saklayın.

2. ARP/MARP Dondurulmuş Stok Kütüphanesi Plaka Hazırlama

1. Bölüm 1'de hazırlanan gliserol stoklarında lb agar ve uygun seçilebilir marker içeren yeni bir Petri yemeği setine arp/MARP suşları çizgi. 37 °C'de bir gecede büyüyün.
2. Aseptik tekniği kullanarak, pipet 500 μL katyon, steril bir rezervuardan 96 derinliğindeki kuyu plakasının her kuyusuna Mueller Hinton suyu (MHB) ayarladı.
3. Adım 2.1'de hazırlanan plakalarla, 96 derin kuyu plakasını ARP/MARP haritasına uygun olarak aşılamak için aplikatör çubuğu kullanın (Ek Şekil 1 ve Ek Şekil 2). Her kuyuya uygun seçilebilir işaretçinin eklenmiştir. Derin kuyu plakayüzeyine nefes alabilen bir sızdırmazlık membranı yerleştirin ve bir gecede 37 °C 'de (250 rpm) kuluçkaya yatırın.
4. ARP/MARP haritasına atıfta bulunarak kontamine kuyu olmadığından emin olun. Kirlenmişse tekrarlayın. Çok kanallı pipettor kullanarak, derin kuyu plakasının her kuyusundan 100 μL'lik steril 96 kuyulu yuvarlak alt plakaya aktarın. Birden çok dondurulmuş stok kitaplık plakası oluşturmak için bu adımı yineleyin.
   NOT: Dondurulmuş stok kütüphanesi plakası kontaminasyonu durumunda 2.1−2.4 adımlarını tekrarlamamak için bir seferde en az 5 kütüphane plakası hazırlamak en iyisidir.
5. Her kuyuya 100 μL steril %50 gliserol pipetleme ve yavaşça yukarı ve aşağı borulama tarafından karıştırın arp / MARP dondurulmuş stok kütüphane plakaları yapma bitirmek.
6. Plakaları steril alüminyum contalarla kaplayın ve her kuyunun ayrı ayrı mühürlenmesini sağlayın.
7. Plakaları numaralandırın ve belirli bir zamanda yeni şablonlar aşılamak için yalnızca bir dondurulmuş stok kitaplık plakası ayırın. Dondurulmuş stok kitaplık plaka kontaminasyon durumunda yedek olarak geri kalanı tutun.
8. Plaka kapağını alüminyum contanın üzerine yerleştirin ve -80 °C'de saklayın.

3. Tohum Kültürü ve Çoğaltma Plakası Hazırlama

1. Bir aplikatör çubuğu kullanarak, 3 mL'lik Streptomyces antibiyotik ortamını (SAM) (veya test edilen organizma için diğer uygun ortam) steril cam boncuk içeren bir test tüpünde (miselyumun parçalanması için) aşılayın. dereplicated. Streptomyces için, yavaşça bir koloninin yüzeyinden sporları kazımak.
2. Aynı ahşap aplikatör çubuğunu kullanarak, Bennett'in agarını içeren bir Petri kabında sterilite kontrolü yerleştirin.
3. Tohum kültürünü 30 °C'de 6 gün (250 rpm) havalandırma ile kuluçkaya yatırın ve sterilite kontrol plakasını 6 gün boyunca 30 °C'de inkübedin.
   NOT: SAM ve Bennett'in medya tarifleri için Tablo 2'ye bakın. Yukarıdaki talimatlar çoğu aktinomisit için uygundur. Diğer bakteri ve mantarlar için gerekli olan büyüme ortamını değiştirin.
4. Bir serolojik pipet içine sıcak Bennett's agar 23 mL aspire tarafından dereplication plakaları hazırlayın ve dikdörtgen Petri çanak(Tablo Malzeme)yüzeyinde eşit dağıtmak , önlemek için pipet içinde orta kalan bırakarak hava kabarcığı oluşumu.
   NOT: Plaka dökmek için kullanılan yüzeyin düz olduğundan emin olun ve agar çok fazla soğumadan önce bu adımı gerçekleştirin; düz bir yüzey sonraki aşamalarında kütüphane sabitleme için zorunludur.
5. Orta plakanın tüm alanlarını kaplayana kadar plakayı yavaşça döndürün ve agar tamamen ayarlanana kadar onu rahatsız etmeyin.
6. Dikdörtgen Petri çanak kapağını bir izleme şablonu olarak kullanarak nitroselüloz membran levhaları(Malzeme Tablosu)hazırlayın, böylece yapraklar çoğaltma plakasının yüzeyine uyun. Çarşafları kesin ve steril bir kese içinde otoklavlayın.
   NOT: Bu membran organizmaların yüzeyinde sporulate sağlar, ikincil metabolitleri aşağıdaki ortama atılır iken. Bir kez büyüdü, membran dereplik için temiz bir yüzey sağlamak için kaldırılır. Membran kağıdının Bennett'in agarının yüzeyine ne kadar yakın olduğu ne kadar yakınsa, çoğaltma sonucu o kadar temiz dir.
7. 6 günlük kuluçkadan sonra kirletici madde bulunmadığından emin olmak için sterilite kontrol plakasını kontrol edin. Kirlenmezse, dikdörtgen Petri kabının kapağını ve bilacı kültürünün 200°L'lik kısmını Bennett'in agarının yüzeyine çıkarın.
8. Eşit steril bir pamuk lu bez kullanarak tüm plaka yüzeyine kültür yayıldı.
9. Petri kabının yüzeyinde kültürün üstüne adım 3.6 hazırlanan nitroselüloz membran yerleştirin. Petri kabının alt kenarına membran Alt kenarı hizalayarak başlayın ve yavaş yavaş plaka üst kenarına alt kenarından membran uygulayın.
10. Membran-agar arayüzü arasında oluşmuş olabilecek hava kabarcıklarını düzeltmek için steril pamuklu bir bez kullanın, membranın agara floş olmasını sağlamak.
11. Kapağı dikdörtgen Petri kabına geri koyun ve baş aşağı kapalı bir plastik torbaya koyun. 30 °C'de 6 gün kuluçkaya yatırın.

4. Dereplication Plaka MHB Kaplama ve ARP/ MARP Kütüphane Plaka Hazırlama

1. 6 gün sonra, 30 °C inkübatörden derepyon plakasını çıkarın. Steril cımbız kullanarak (otoklavveya iyice püskürtülür 70% etanol), dikkatle Bennett's agar yüzeyinden nitroselüloz membran kaldırın.
   NOT: Bu adım, 4.2 adımını kolaylaştırarak, derepifasyon için temiz bir yüzey sağlamak için membran yüzeyinde yetişen hidrofobik sporları ve miseli ortadan kaldıracaktır.
2. Adım 3.4 için açıklandığı gibi, çalışma yüzeyinin düz olduğundan emin olun ve 23 mL'lik sıcak katyon ayarlı MHB agar aspire etmek için serolojik pipet kullanın. Dereplication plakasının yüzeyine 20 mL eşit olarak dağıtarak, hava kabarcığı oluşumunu önlemek için ortamın geri kalanını pipette bırakarak bir kaplama oluşturun.
3. Orta tüm alanları kaplayana kadar plakayı yavaşça döndürün ve agar tamamen ayarlanana kadar onu rahatsız etmeyin. Soğuduktan ve katılaştırıldıktan sonra, çoğaltma plakasını kapalı plastik torbaya geri döndürün ve bir gecede 4 °C'de ters bir şekilde saklayın.
   NOT: Bu adım, fermente Bennett'in medyumundan ikincil metabolitlerin MHB agar kaplamasına difüzyonunu sağlar. Nitroselüloz membran düzgün hazırlanmış değilse plaka kenarlarında spor büyüme olacak, Hangi MHB agar püskürtmek hidrofobik özelliklere sahip. Bindirmeyi bu sporların üzerine dökmeyin, çünkü bindirmenin kirlenmesine neden olabilir.
4. Bindirmenin döküldüğü gün, 96 kuyulu bir plakanın her kuyusuna 100 μL katyon ayarlı MHB boru sulandırarak yeni bir ARP/MARP şablonuna inoküledin.
   NOT: Dereplik sırasında kontaminasyon yayılma olasılığını azaltmak için, yalnızca 2−3 dereplication plakasını çoğaltmak için tek bir ARP/MARP kitaplık plakası kullanın. Bu nedenle, dereplicated olacak suşların sayısına göre yeterli 96-iyi ARP / MARP plakaları aşılamak.
5. -80 °C'lik dondurucudan dondurulmuş stok ARP/MARP kütüphane plakasını çıkarın. Yoğuşma alt tarafında oluşmaya başlamadan önce alüminyum mührü çıkarın, bu nedenle kütüphane plakasında komşu kuyuları kirletme olasılığını azaltarak.
6. Steril 96 kuyulu sabitleme araçları (veya diğer aşılama ekipmanları) kullanarak, dondurulmuş stok ARP/MARP kütüphane plakasından dikkatlice sabitlenin ve 96 kuyulu yeni MHB içeren plakaları aşılayın. Dereplik sırasında kontaminasyonu en aza indirmek için, kütüphane plakası başına yalnızca 2−3 dereplik plakasını çoğaltmak için gereken sayıda ARP veya MARP kitaplık plakası kadar hazırlayın. Her plaka aşılama arasında sabitleme araçları sterilize.
7. Dondurulmuş şablona yeni bir steril alüminyum conta koyun ve -80 °C'lik dondurucuya geri döndürün. Aşılanmış 96 kuyulu plakaları kapalı bir plastik torbanın içine yerleştirin ve 37 °C'de kuluçkaya yatırın ve 18 saat boyunca havalandırma (250 rpm) ile kuluçkaya yatırın.
   NOT: Yeni dondurulmuş stok kütüphane plakaları hiçbir kontaminasyon mevcut olduğundan emin olduktan sonra bu adımdan hazırlanabilir. Adım 2.5 açıklandığı gibi -80 °C'de depolamadan önce tabağa gliserol ekleyin.

5. ARP/MARP kullanarak çoğaltma

1. ARP/MARP şablonu kuvözden çıkarın ve hiçbir kirletici madde bulunmadığından emin olun. Her zaman taze hazırlanmış ve doğrudan dondurulmuş stoktan değil bir şablon kullanarak çoğaltmak.
2. Dereplication plakaları 4 °C'den çıkarın ve oda sıcaklığına dengede izin verin. Yoğuşma varsa, kapakları açın ve steril bir ortamda kurumasını bekleyin.
3. Steril sabitleme araçları (veya diğer aşılama ekipmanları) kullanarak, ARP/MARP kütüphane plakasından çoğaltma plakalarının MHB agar kaplamasının yüzeyine sabitle. Agar'ı delmemeye dikkat et. Her ayrıştırıcıplaka nın aşılanması arasında sabitleme araçlarını sterilize edin.
4. Şablonu çoğaltma plakalarının yüzeyine yapıştırdıktan sonra, şablon inoculumun 3−5 dk kurumasını bekleyin. aşılanmış ayrıştırıcıplakaları kapalı plastik bir torbaya ters yerleştirin ve gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
5. Dereplication sonuçları ertesi gün, çoğaltma plakası üzerindeki büyümeyi ARP/MARP haritasına karşılık gelen kuyularla karşılaştırarak analiz edin(Tablo 3 ve Tablo 4).

Aşağıdaki sonuçlar, antibiyotik üreten bir ilgi suşlarının arp ve/veya MARP kullanılarak çoğaltılması yla elde edilebildi.

ARP/MARP dereplik iş akışının diyagramı Şekil 1'degösterilmiştir ve kütüphane plaka haritaları Ek Şekil 1 ve Ek Şekil 2'degösterilmiştir. Şekil 2, çevresel ekstre WAC 8921'in kloramfenikol üreticisi olarak tanımlandığı pozitif bir dereplik sonucu göstermektedir. Şekil 3 tamamen ARP büyüme eksikliği gösterir, hangi arp / MARP kütüphane plaka sıyrık değildir ya bilinmeyen bir antibiyotik ya da daha az yaygın olarak bulunan antibiyotik varlığını gösterir. Şekil 4, hem yabani tip E. coli BW25113 hem de hiperpermeable ve efflux eksik mutant E. coli BW25113 ΔbamBΔtolC kullanımı nedeniyle MARP'ya özgü bir büyüme paterni göstermektedir. Bu sonuç bozulmamış bir dış membran aşmak mümkün değildir antimikrobiyal aktivite ile bir bileşiğin varlığını göstermektedir. Şekil 5 sabitleme araçlarının yanlış sterilizasyonunu öneren bir E. coli büyüme deseni gösterir ve Şekil 6, ARP/MARP dondurulmuş stok kitaplığı plakasının kirlenmesine bir örnek gösterir. Şekil 7, agar kaplamasının dereplasyon sırasında delinmesi durumunda ne olduğunu göstermektedir. Son olarak, Şekil 8 dereplik işlemi sırasında oluşabilecek MHB bindirme ile ilgili kontaminasyonu gösterir.

Şekil 1: Çoğaltma işleminin şeması. Dereplicated için üretim zorlanma bir çim olarak dikdörtgen Petri çanak üzerine çizgili ve bir nitroselüloz membran üstüne yerleştirilir. Plaka daha sonra 6 gün boyunca kuluçkaya yatırılır ve üretilen ikincil metabolitler Petri kabına salgılanırken, üretim-gerinimle ilgili biyokütle membran yüzeyinde büyür. 6 günlük fermantasyon döneminden sonra membran çıkarılır ve sabitleme için pürüzsüz bir yüzey sağlamak için antibiyotik içeren ortam yüzeyine bir MHB kaplaması eklenir. ARP/MARP Haritaları'na göre 96 kuyulu plaka biçiminde düzenlenmiş olan ARP/MARP E. coli kütüphanesi, kaplamanın yüzeyine sabitlenir. Tepsiyi bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yattıktan sonra, belirli direnç genlerini ifade eden E. coli suşlarının büyümesi üretilen bileşiğin kimliğini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Bilinen bir antibiyotiğin replikasyonu. Üreten gerinim WAC 8921, ARP şablonu kullanılarak çoğaltıldı. E. coli BW25113 ΔbamBΔtolC pGDP1: MHB agar kaplamayüzeyindekiCAT, WAC 8921'in kloramfenikol üreticisi olduğunu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Bilinmeyen bir antibiyotiğin çoğalması. Üreten gerinim WAC 9941, ARP şablonu kullanılarak çoğaltıldı. Dikdörtgen Petri kabının yüzeyinde E. coli kütüphane büyüme eksikliği görüldü, ya WAC 9441 bilinmeyen bir antimikrobiyal bileşik veya ARP hesaba katılmaz nadir bir antibiyotik üreten olduğunu belirten. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Bozulmamış bir dış zardan geçemeyen bir antimikrobiyal bileşiğin tanımlanması. Üreten gerinim WAC 4178 MARP şablonu kullanılarak çoğaltıldı. E. coli BWi BW25113 suşları ikincil metabolit içeren ortamın yüzeyinde büyüme yeteneğine sahiptir, oysa E. coli BW25113 3δδtolC'nin tüm suşları büyüyemez. Bu WAC 4178 bozulmamış bir dış membran çapraz olamaz bir antimikrobiyal bileşik ürettiğini göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Steril olmayan sabitleme araçlarına bağlı kontaminasyon. Üreten gerinim WAC 7094, ARP şablonu kullanılarak çoğaltıldı. Atanmış E. coli suşu olmayan alanlarda E. coli kütüphane büyümesinin varlığı, dikdörtgen Petri kabının MHB agar bindirmesini aşılamak için kullanılan sabitleme araçlarının düzgün bir şekilde sterilize edilmemişolduğunu göstermektedir. Bu bindirme arasında bilinmeyen E. coli suşları transferi ile sonuçlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Kirlenmiş dondurulmuş stok ARP/MARP şablonuna bağlı kontaminasyon. Üreten gerinim WAC 3683 ARP şablonu kullanılarak çoğaltıldı. Dikdörtgen Petri çanak yüzeyinde üç farklı E. coli kolonisi büyüdü: iki e. coli BW25113 ΔbamBΔtolC stat, bir streptothricin direnç enzimi ifade karşılık gelir, ve diğer E. coli BW25113 ΔbamBΔtolC ifade VIM-2_ss, bir β-laktam direnç enzimi. Bla_VIM2ss koloni büyümesinin çoğaltılamazlığı nedeniyle, bu iki antibiyotik sınıfı arasında meydana geldiği bilinen çapraz direnç eksikliğine ek olarak, E. colibamBΔ Δ dışında bir suş olduğu varsayılabilir tolC pGDP1: bla_VIM2ss iyi ilgili dondurulmuş kütüphane plaka büyüyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Delinmiş MHB agar kaplaması. Üreten gerinim WAC 5106, ARP şablonu kullanılarak çoğaltıldı. Bu suş, E. coli BW25113 ΔbamBΔtolC pGDP3:aph(6)-Ia'nın büyümesinde belirtildiği gibi streptomisin üreticisi olarak bulunmuştur. Plakanın çevresi boyunca MHB agar kaplama yüzeyinde delinme delikleri görülebilir. Bu çoğaltma sonuçlarını etkilemese de, verilerin ilk bakışta yorumlanması zor olabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: MHB agar kaplamasının kirlenmesi. Kontamine MHB agar 37 °C'de bir gecede plaka kuluçka sonra görünür hale bindirme yüzeyinde düzensiz bir büyüme deseni üretir. E. coli büyümesi kontaminasyon yoluyla hala görülebilse de, plakadan veri tahmin etmeden önce deneyi tekrarlamaları tavsiye edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: pGDP plazmid serisinde kullanılan seçilebilir belirteçler. Her plazmid için doğru konsantrasyonda uygun seçilebilir marker içeren LB agar Petri kapları üzerine ARP / MARP E. coli suşları Streak.

Tablo 2: SAM ve Bennett medya ve Czapek mineral karışımı için Tarifler. Otoklavlamadan önce SAM ve Bennett'in pH 6.8'ini ayarlayın ve Czapek mineral karışımını filtreleyin.

Tablo 3: Peki en az ARP suşları için atama tablosu. Bu tablo, en az ARP suşlarının her birinin en az ARP kitaplık plaka haritasına göre bulunabileceğini 96 kuyulu bir plakanın hangi kuyuda bulunabileceğini gösterir. Tablo da her gen direnç confers hangi antibiyotik sınıfı listeler. Bazı genlerin verilen antibiyotik sınıfı içinde birden fazla antibiyotiğe direnç gösterebileceğini lütfen unutmayın.

Tablo 4: ARP suşları için iyi atama tablosu. Bu tablo, ARP suşlarının her birinin ARP kitaplık plaka haritasına göre bulunabileceğini 96 kuyulu bir plakanın hangi kuyuda bulunabileceğini gösterir. Tablo da her gen direnç confers hangi antibiyotik sınıfı listeler. Bazı genlerin verilen antibiyotik sınıfı içinde birden fazla antibiyotiğe direnç gösterebileceğini lütfen unutmayın.

Ek Şekil 1: Orijinal antibiyotik direnci platformu (ARP) şablonu için kullanılan kütüphane plakası haritası. Gerekli tüm kontrollerin ve yinelemelerin dahil edilmesini sağlamak için bu formatı kullanarak ilgili E. coli suşlarını 96 kuyulu bir plaka halinde düzenleyin. Bu rakam Cox ve ark.^10'dandeğiştirilmiştir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: Minimum antibiyotik direnci platformu (MARP) şablonu için kullanılan kütüphane plakası haritası. Gerekli tüm kontrollerin ve yinelemelerin dahil edilmesini sağlamak için bu formatı kullanarak ilgili E. coli suşlarını 96 kuyulu bir plaka halinde düzenleyin. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Yukarıda açıklanan protokol, hem yeni antimikrobiyal bileşiklerin keşfine hem de aktivitelerini kurtarmak için mevcut antibiyotiklerle birlikte kullanılabilecek adjuvants'a uygulanabilir. Platform direnç mekanizmaları ve onların cognate antibiyotikyüksek substrat özgüllüğü yararlanır, ham doğal ürün özleri içinde bileşikleri dereplicate için. Dereplication plakaları için gerekli süre uzun olmasına rağmen (~2 hafta), derepyon işleminin kendisi tek bir gecelik kuluçka döneminden sonra tamamlanır, bu da bir izole etmek ve karakterize etmek için gereken süreye kıyasla hızlıdır. ham özler bileşik. Ayrıca, hiçbir pahalı veya son derece özel ekipman gereklidir, bu platform erişilebilir ve maliyet-etkin hale.

Bu platformun bir diğer önemli yararı esnekliğidir. ARP daha fazla antibiyotik sınıfları kapsayan direnç genleri içerecek şekilde genişletilebilir. Bu, yeni direnç enzimlerinin ortaya çıkışı için literatürün izlenmesi ve genlerin E. coli kütüphanesine eklenmesi için temel moleküler klonlama teknikleri kullanılarak elde edilir. Ayrıca, çoğaltma şablonu, bir bireyin çoğaltma yaparken kullanmak istediği geniş veya dar aralıklı substrat özgüllüğü istenilen düzeye göre özelleştirilebilir. E. coli kitaplığındaki genlerin herhangi bir kombinasyonu, farklı profillere sahip bileşikleri tespit etme yeteneğiyle yeni kütüphane plakaları yapmak için kullanılabilir. Örneğin, E. coli şablonu ifade eden bir β-laktamaz β-laktamların ve farklı alt sınıflarının çok özel derepiyonuna izin verecek şekilde geliştirilebilir.

Bu platform başlangıçta katı ortamdaki bileşikleri çoğaltmak için tasarlanmış olsa da, aynı zamanda sıvı ortamda da çalışır. Bu, test etmek için yalnızca sınırlı bir miktarın mevcut olduğu halde zaten saflaştırılmış bileşiklerle çalışırken veya katı ortamda kolayca veya tutarlı bir şekilde dağılmayan bileşiklerle çalışırken yararlıdır. Son olarak, bu protokol E. coli suşları BW25113 ve BW25113 ΔbamBΔtolC kullanılarak tanımlanmış olsa da, platform E. coli'nin farklı suşlarında ifade edilen direnç gen kitaplığı ile kullanılabilir (dereplication fenotipler değişebilir). Sonuçta, Antibiyotik Direnç Platformu esnek, birçok uygulama vardır, ve diğer dereplication yöntemleri üzerinde avantajlıdır.

Tekrarlanabilir ve kontamine olmayan sonuçlar elde edilmesini sağlamak için uygun sterilizasyon ve aseptik teknikleri nizlemesi çok önemlidir. Aksi takdirde sabitleme araçlarının, kitaplık plakasının veya çoğaltma plakasının kendisi kirlenmeye neden olur. E. coli kütüphanesinde seçilebilir belirteçler bulunurken, bu durum işaretleyicinin eksik olması nedeniyle oluşan kontaminasyonu önlemeye yardımcı olabilir, aynı belirteç kullanarak suşların çapraz kontaminasyonunu engellemez. Bunun olma riskini azaltmak için, kütüphane plakasından sabitlemeden önce bakteri sabitleme araçlarını dikkatlice sterilize etmek esastır. Her kitaplık plakası, yeni bir şablon için atılmadan önce en fazla 3−4 kez sabitlenmelidir. Bu, sabitleme işlemi sırasında bir kütüphane plakası kirlenirse, kontaminasyonun tüm çoğaltma plakaları arasında yayılmasını önler. Ayrıca, dereplication plaka aşılanırken hiçbir antibiyotik kullanılır ve bu nedenle büyük bir bakım altı gün boyunca mayalanmaya bırakılır önce kontaminasyonu önlemek için alınmalıdır. Bir diğer olası kontaminasyon kaynağı da dereplik plakasının MHB agar kaplamasIdır. Eğer bindirme ortamı kirlenmişse, büyüme sadece 37 °C'de bir gecede kuluçka dan sonra ortaya çıkar. Bindirme kontaminasyonu, Bindirme yüzeyindeki E. coli kütüphanesinin büyümesini analiz etmeyi son derece zorlaştırabilir. Bindirme kontaminasyonu olasılığını azaltmak için, bindirme dökmeden önce MHB agar taze hazırlayın. Bir birey bu yöntemile rahat olana kadar, dereplication plakaları her zaman çoğaltılması veya bir plaka kirlenmesi durumunda, veri hala umut ayıklanabilir gibi triplicate hazırlanması tavsiye edilir kirlenmemiş plakalar.

Son olarak, ARP/ MARP sınırlamaları olduğunu unutmayın. Bu protokol, birden fazla biyoaktif bileşik üreten üretim-suşların replikasyonu için uygun değildir. E. coli kütüphanesindeki her tür, tek bir direnç genini ifade etmek için tasarlanmıştır. Eğer iki antibiyotik bir organizma tarafından üretiliyorsa, ne direnç geni ikinci antibiyotiğe direnç gösterir, bu da her iki suşun da hücre ölümüyle sonuçlanır. Bu nedenle, birden fazla antibiyotik üretimi mevcut tek yapı E. coli kütüphane tarafından tespit edilemez çünkü dereplication sonuçları yeni bir antibiyotik varlığını düşündürmektedir bu olasılığı göz önünde bulundurulmalıdır. Birden fazla antibiyotik üreten suşları çoğaltma meydan mücadele için alınabilir bir yaklaşım Cox ve ark.¹⁰tarafından orijinal ARP kağıt açıklanan agar-plug prosedürü kullanarak içerir. Bu yöntemde, fermente katı ortamın bir kısmı plaka içeren bir antibiyotik üreticisinden çıkarılır ve arp suşu nun bir çimeninüzerine yerleştirilir. Gösterge gerinim, ARP kitaplığındaki dirençli E. coli suşlarından herhangi biri olabilir. İnhibisyon bölgeleri daha sonra ARP suşları ve vahşi tip suşu karşı bir üretim-suşu biyoaktivite karşılaştırmak için kullanılır. Yabani tip zorlanmaya göre küçülmüş boyutta bir inhibitör bölge oluşturan ARP suşları, üretilen bileşiğe karşı koyabilir. Bu yöntem birden fazla antibiyotik üretme yeteneğine sahip suşları belirlemede etkili olduğu kanıtlanmıştır¹⁰.

Özetle, ARP/MARP ile çoğaltma yaparken en iyi sonuçları elde etmek için çoğaltma plakalarının yinelenen veya üç leme halinde hazırlanması önerilir. Protokoldeki diğer kritik adımlar arasında taze bir kütüphane plakasından sabitleilmesi (hiç donmaması) ve membran kaldırma aşamasında üretim-zorlanmadan mümkün olduğunca çok biyokütlenin çıkarılması yer almaktadır. Gerekli tüm adımlar izlenirse, iki haftalık bir zaman dilimi içinde bir üretim-ilgi zorlanma için başarılı çoğaltma sonuçları olmalıdır.